Καινοτομίες στη γονιδιωματική επεξεργασία και οι εφαρμογές τους στην έρευνα της μυοκαρδιοπάθειας

Με τον όρο μυοκαρδιοπάθειες ορίζονται οι δομικές ή/και λειτουργικές ανωμαλίες που επηρεάζουν το μυοκάρδιο και οι οποίες προκύπτουν απουσία ορισμένης υποκείμενης νόσου ικανής να προκαλέσει παθολογία του μυοκαρδίου. Οι ασθενείς συχνά παρουσιάζουν διαταραχή της καρδιακής λειτουργίας και αυξημένο ρίσκο καρδιακής ανεπάρκειας, ένα σοβαρό κλινικό σύνδρομο το οποίο χαρακτηρίζεται από ανισορροπία μεταξύ της παροχής και ζήτησης οξυγόνου. Η καρδιακή ανεπάρκεια θεωρείται μία αναδυόμενη πανδημία, η οποία επιβάλλει τεράστιο κόστος υγειονομικής περίθαλψης μέσω της νοσηρότητας, των υψηλών ποσοστών νοσηλείας, της πρόωρης θνησιμότητας και της απώλειας παραγωγικότητας.

Μία άλλη κατηγορία της νόσου αποτελεί η υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια (hypertrophic cardiomyopathy, HCM). Οι εκτιμήσεις του επιπολασμού της HCM προέρχονται κυρίως από ανεπτυγμένες χώρες με εξελιγμένα ιατρικά συστήματα και υποδηλώνουν εμφάνιση 1: 500 άτομα στον γενικό πληθυσμό με βάση την κλινική έκφραση της νόσου.

Με πιο χαμηλή συχνότητα, η αρρυθμιογόνος μυοκαρδιοπάθεια (arrhythmogenic cardiomyopathy, ACM) έχει εκτιμώμενο επιπολασμό που κυμαίνεται από 1: 1.000 έως 1: 5.000 άτομα, με τη διαφορά να αποδίδεται συχνά σε εσφαλμένες διαγνώσεις.

Τέλος, η περιοριστική μυοκαρδιοπάθεια (restrictive cardiomyopathy, RCM) είναι η πιο σπάνια από τις κύριες μυοκαρδιοπάθειες και προκαλείται κυρίως από επίκτητους και όχι από γενετικούς παράγοντες. Η RCM με γενετικό υπόβαθρο αντιπροσωπεύει λιγότερο από το 5% του συνόλου των περιπτώσεων μυοκαρδιοπάθειας και κρίνεται ως θανατηφόρος νόσος.

Οι μυοκαρδιοπάθειες φαίνεται πως προκαλούνται από μεταλλάξεις που διαταράσσουν την έκφραση και τη λειτουργία μυριάδων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων μεταγραφικών παραγόντων, ενζύμων και ιοντικών διαύλων. Αν και πολυάριθμες μελέτες έχουν εμπλουτίσει τις γνώσεις μας για την παθοφυσιολογία της νόσου, οι τρέχουσες διαθέσιμες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τις γενετικές μυοκαρδιοπάθειες επικεντρώνονται στη θεραπεία των συμπτωμάτων παρά στην αντιμετώπιση των υποκείμενων γενετικών αιτιών. Τα τελευταία χρόνια, το πεδίο της καρδιαγγειακής έρευνας έχει επωφεληθεί πολύ από τις τεχνολογίες γονιδιωματικής επεξεργασίας, ιδιαίτερα τις τεχνολογίες που σχετίζονται με το σύστημα CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), οι οποίες επέτρεψαν την ανάπτυξη κλινικά σχετικών μοντέλων ασθενειών για τη διερεύνηση των υποκείμενων γενετικών και μοριακών μηχανισμών της μυοκαρδιοπάθειας.

Το σύστημα CRISPR-Cas αποτελεί μέρος ενός προσαρμοστικού ανοσοποιητικού συστήματος των βακτηρίων και αρχαίων, το οποίο παρέχει προστασία από την εισβολή ξένου γενετικού υλικού (1). Η δυνατότητα να εκτελεί διάσπαση του προκαρυωτικού DNA σε συγκεκριμένες θέσεις που υποδεικνύονται από RNA αλληλουχίες, αποδείχθηκε αμέσως ένα πολύτιμο εργαλείο για την επεξεργασία και ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων.

Το σύστημα CRISPR-Cas κατηγορίας II έχει προσαρμοστεί για επεξεργασία γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα μέσω της απλοποίησής του σε 2 συστατικά: το sgRNA (single-guide RNa), που καθοδηγεί το σύστημα στην αλληλουχία στόχο και την ενδονουκλεάση Cas (CRISPR-associated protein), που έχει ως ρόλο τη διάσπαση του DNA. Πιο συγκεκριμένα, η πρόσδεση του sgRNA μέσω συμπληρωματικότητας στις αλληλουχίες-στόχο στο DNA, κατευθύνει την πρωτεΐνη Cas σε σύντομες γειτονικές αλληλουχίες που ονομάζονται PAM (protospacer adjacent motif) και αποτελούν τις αλληλουχίες στόχου της ενδονουκλεάσης (2). Με την πρόσδεση της στις PAM, η Cas δημιουργεί διάσπαση της δίκλωνης έλικας του DNA στο συγκεκριμένο σημείο.

Η ανακάλυψη και οι εφαρμογές του συστήματος CRISPR-Cas έφεραν επανάσταση στην επεξεργασία του γονιδιώματος και μεταμόρφωσαν τη βιοϊατρική έρευνα, μεταφέροντας τη γονιδιακή στόχευση σε μία νέα εποχή.

Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται νέα συστήματα CRISPR-Cas που στοχεύουν να ενισχύσουν την αποτελεσματικότητα και την ειδικότητα της στόχευσης. Η έρευνα για τη χρήση του CRISPR-Cas στη γονιδιωματική επεξεργασία στοχεύει σε δύο τεχνικές, την επεξεργασία γονιδιώματος στο επίπεδο μίας βάσης (base editing) και την πρωταρχική επεξεργασία του γονιδιώματος (prime editing). Η πρώτη βασίζεται σε δύο κλάσεις επεξεργαστών αζωτούχων βάσεων του DNA, τους επεξεργαστές της αζωτούχου βάσης αδενίνης (adenine base editors, ABEs) και τους επεξεργαστές της κυτοσίνης (cytosine base editors, CBEs).

Οι περιορισμοί της συγκεκριμένης τεχνικής αφορούν κυρίως στην ακρίβεια της και στους μηχανισμούς χορήγησης της, ειδικά όταν στοχεύονται πολύπλοκα και ετερογενή όργανα όπως η καρδιά. Στα πλαίσια των προσπαθειών αύξησης της ακρίβειας στόχευσης αναπτύχθηκαν οι πρωταρχικοί επεξεργαστές που αποτελούν μέρος του συστήματος prime editing, της δεύτερης τεχνικής επεξεργασίας που χρησιμοποιείται. Οι in vivo μελέτες που έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιώντας αυτές τις δύο τεχνικές στοχεύουν στην ανάπτυξη μοντέλων για τις μυοκαρδιοπάθειες και συνοψίζονται ως εξής:

• πρώτη εφαρμογή του συστήματος CRISPR για γονιδιωματική επεξεργασία το 2012.
• ανάπτυξη των πρώτων CBEs και ΑΒΕs το 2016 και 2017 αντίστοιχα.
• πρώτη χρήση ΑΒΕ σε in vivo μοντέλο για μυϊκή δυστροφία Ντουσέν (Duchenne muscular dystrophy, DMD) το 2018 και ανάπτυξη μοντέλου για την DMD σε ποντίκια με in vivo χρήση ABE το 2021.
• πρώτη ένδειξη επιτυχούς χρήσης ABE σε μοντέλο ποντικού με HCM το 2021.
• χρήση των τεχνικών base editing και prime editing σε μοντέλο για DMD το 2021.
• θεραπευτική παράλειψη εξονίου με χρήση CBE σε DMD μοντέλο ποντικού το 2021.
• ανάπτυξη in vitro μοντέλου για το σύνδρομο μακρού QT (long QT syndrome, LQTS) χρησιμοποιώντας ΑΒΕ το 2022.
• πρώτη ένδειξη για επιτυχή εφαρμογή ΑΒΕ σε ένα DCM μοντέλο το 2022.
• πρώτη επιτυχής θεραπευτική χρήση ΑΒΕ σε in vitro και in vivo μοντέλα του HCM το 2023.

Είναι εντυπωσιακό πως οι base editing έχουν ήδη εισέλθει σε κλινικές δοκιμές για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία (NCT05456880), τη β-θαλασσαιμία (NCT05442346) και την οικογενή υπερχοληστερολαιμία (NCT05398029).
Οι θεραπείες γονιδιωματικής επεξεργασίας υπόσχονται μία ενιαία, οριστική θεραπεία με διαρκή οφέλη, απαλλάσσοντας τα νοσούντα άτομα από την υποχρέωση να τηρούν παρατεταμένα μη ειδικά ιατρικά σχήματα που μπορεί να επηρεάσουν αρνητικά την ποιότητα ζωής τους.

Στο πλαίσιο της μυοκαρδιοπάθειας, αυτό είναι ένα ιδιαίτερα σημαντικό ζήτημα, καθώς οι υπάρχουσες θεραπευτικές στρατηγικές επικεντρώνονται κυρίως στην άμβλυνση των συμπτωμάτων της νόσου, σε αντίθεση με την άμεση θεραπεία της νόσου. Αναμφίβολα, η ενσωμάτωση προσεγγίσεων γονιδιακής θεραπείας στην κλινική πρακτική αναμένεται να έχει πολύ σημαντικά οφέλη για τα νοσούντα άτομα και για αυτό οι όποιες εξελίξεις αναμένονται με μεγάλο ενδιαφέρον.

Κύρια πηγή άρθρου:
Kyriakopoulou, E., Monnikhof, T., & van Rooij, E. (2023). Gene editing innovations and their applications in cardiomyopathy research. Disease Models & Mechanisms, 16(5), dmm050088. https://doi.org/10.1242/dmm.050088

Επιπλέον βιβλιογραφικές πηγές:
1. Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J. J., Charpentier, E., Horvath, P., Moineau, S., Mojica, F. J. M., Wolf, Y. I., Yakunin, A. F., van der Oost, J., & Koonin, E. V. (2011). Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467–477. https://doi.org/10.1038/nrmicro2577
2. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829

Πηγη: https://hellenicmedicalreview.gr/