Μια νέα φασματοσκοπική μέθοδος υπόσχεται να αλλάξει τον τρόπο με τον οποίο οι επιστήμονες βλέπουν τις πρωτεΐνες και τα φάρμακα που τις στοχεύουν. Η τεχνική TRIP καταγράφει μικροσκοπικές δονήσεις μορίων, αποκαλύπτοντας αλληλεπιδράσεις που μέχρι σήμερα έμεναν σε μεγάλο βαθμό αόρατες.
Η ανακάλυψη ενός φαρμάκου δεν κρίνεται μόνο από το αν ένα μόριο φαίνεται υποσχόμενο σε έναν υπολογιστή ή σε ένα χημικό μοντέλο. Κρίνεται από το αν μπορεί να δράσει μέσα στο πραγματικό, ασταθές και πυκνό περιβάλλον των βιολογικών συστημάτων. Εκεί, οι πρωτεΐνες διπλώνονται, αλλάζουν σχήμα, ενώνονται, απομακρύνονται και αλληλεπιδρούν με φάρμακα μέσα από δυνάμεις τόσο λεπτές, ώστε για δεκαετίες οι επιστήμονες μπορούσαν κυρίως να τις υποθέτουν.
Τώρα, ερευνητές στο Texas A&M University παρουσιάζουν μια τεχνική που φιλοδοξεί να αλλάξει αυτή την εικόνα. Η μέθοδος ονομάζεται Thermostable Raman Interaction Profiling, ή TRIP, και χρησιμοποιεί λέιζερ για να καταγράψει τις δονήσεις μορίων σε πρωτεΐνες και φαρμακευτικά σύμπλοκα. Η καινοτομία της δεν βρίσκεται απλώς στο ότι «βλέπει» τις πρωτεΐνες. Βρίσκεται στο ότι επιχειρεί να μετρήσει άμεσα τις κβαντικής φύσης αλληλεπιδράσεις που βοηθούν τις πρωτεΐνες να αποκτούν δομή και τα φάρμακα να ασκούν δράση.
Αλληλεπιδράσεις
Η δημοσίευση στο Science Advances επικεντρώνεται σε ένα φαινόμενο που μπορεί να ακούγεται τεχνικό, αλλά έχει μεγάλη βιολογική σημασία: τις αρωματικές π-π αλληλεπιδράσεις, γνωστές και ως pi-pi stacking. Πρόκειται για λεπτές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε δακτυλιοειδή μόρια, τα οποία μπορούν να ευθυγραμμιστούν ή να στοιβαχθούν μεταξύ τους, επηρεάζοντας τη σταθερότητα των πρωτεϊνών, την αναγνώριση μορίων και την αποτελεσματικότητα φαρμάκων.
Στη γλώσσα της φαρμακευτικής έρευνας, αυτό σημαίνει κάτι πολύ πρακτικό: αν ένα φάρμακο δεν «κάθεται» σωστά στον πρωτεϊνικό του στόχο, μπορεί να αποτύχει. Αν όμως οι επιστήμονες μπορούν να μετρήσουν με ακρίβεια τις δυνάμεις που το κρατούν εκεί, τότε μπορούν να σχεδιάσουν καλύτερα μόρια, να ξεχωρίσουν νωρίτερα τους ισχυρότερους υποψήφιους αναστολείς και να μειώσουν τον χρόνο που χάνεται σε λιγότερο αποτελεσματικές επιλογές.
Τι είναι οι π-π αλληλεπιδράσεις και γιατί έχουν σημασία
Στο εσωτερικό των κυττάρων, οι πρωτεΐνες δεν είναι ακίνητες κατασκευές. Είναι δυναμικά μόρια που μετακινούνται, διπλώνονται και αλλάζουν μορφή ανάλογα με το περιβάλλον τους. Η λειτουργία τους εξαρτάται από πολλές δυνάμεις: δεσμούς υδρογόνου, ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβες περιοχές, μεταβολές φορτίου και λεπτές αρωματικές αλληλεπιδράσεις.
Οι π-π αλληλεπιδράσεις αφορούν αρωματικούς δακτυλίους, όπως εκείνους που υπάρχουν σε αμινοξέα και σε πολλά φαρμακευτικά μόρια. Όταν αυτοί οι δακτύλιοι πλησιάζουν και ευθυγραμμίζονται, δημιουργούν ασθενείς αλλά κρίσιμες δυνάμεις. Δεν σχηματίζεται ένας κλασικός χημικός δεσμός με τον τρόπο που τον φαντάζεται κανείς σε ένα σχολικό βιβλίο. Παρ’ όλα αυτά, το αποτέλεσμα μπορεί να καθορίσει αν μια πρωτεΐνη σταθεροποιείται, αν δύο πρωτεϊνικά τμήματα ενώνονται ή αν ένα φάρμακο παραμένει αρκετά ισχυρά δεσμευμένο στον στόχο του.
Ο καθηγητής Philip Hemmer περιγράφει αυτές τις αλληλεπιδράσεις ως ένα είδος βιολογικού Velcro. Η εικόνα είναι απλή αλλά εύστοχη: δεν πρόκειται για έναν ισχυρό, άκαμπτο δεσμό, αλλά για πολλές μικρές δυνάμεις που, όταν λειτουργούν συντονισμένα, μπορούν να κρατήσουν μια μοριακή δομή στη θέση της.
Αυτός είναι και ο λόγος που οι π-π αλληλεπιδράσεις ενδιαφέρουν τόσο έντονα τη φαρμακευτική έρευνα. Πολλά φάρμακα περιέχουν αρωματικούς δακτυλίους. Πολλοί πρωτεϊνικοί στόχοι έχουν περιοχές όπου τέτοιοι δακτύλιοι συμμετέχουν στη δομή ή στη λειτουργία τους. Αν μια τεχνική μπορεί να δείξει με άμεσο τρόπο πόσο ισχυρές είναι αυτές οι αλληλεπιδράσεις, τότε προσφέρει ένα νέο επίπεδο πληροφορίας στον σχεδιασμό φαρμάκων.
Το πρόβλημα των παλαιότερων μεθόδων
Μέχρι σήμερα, οι επιστήμονες χρησιμοποιούσαν ισχυρά εργαλεία για να μελετήσουν τις πρωτεΐνες: κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, φασματομετρία μάζας, υπολογιστική μοντελοποίηση, κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία και άλλες μεθόδους. Αυτές οι τεχνικές έχουν αλλάξει ριζικά τη βιοϊατρική έρευνα. Έχουν αποκαλύψει δομές, θέσεις δέσμευσης, διαμορφώσεις και μηχανισμούς.
Όμως, σε μεγάλο βαθμό, οι λεπτές π-π αλληλεπιδράσεις προσεγγίζονταν έμμεσα. Οι ερευνητές μπορούσαν να δουν ότι δύο αρωματικοί δακτύλιοι βρίσκονται κοντά ή ότι μια πρωτεΐνη παίρνει συγκεκριμένη δομή. Μπορούσαν να υποθέσουν ότι μια αλληλεπίδραση συμβάλλει στη σταθερότητα ή στη δράση ενός φαρμάκου. Δεν μπορούσαν όμως εύκολα να μετρήσουν άμεσα, σε συνθήκες κοντά στο φυσιολογικό περιβάλλον, την ίδια τη δύναμη αυτής της αλληλεπίδρασης.
Η TRIP επιχειρεί να καλύψει αυτό το κενό. Δεν αντικαθιστά τις υπάρχουσες μεθόδους. Τις συμπληρώνει. Αν οι δομικές τεχνικές δείχνουν πού βρίσκονται τα μόρια, η TRIP προσπαθεί να δείξει πώς αλλάζουν οι εσωτερικές τους δυνάμεις όταν πλησιάζουν, στοιβάζονται ή δεσμεύονται σε φαρμακευτικά μόρια.
Πώς λειτουργεί η TRIP
Η TRIP βασίζεται στη φασματοσκοπία Raman, μια τεχνική που χρησιμοποιεί φως για να καταγράψει τις δονήσεις χημικών δεσμών. Όταν ένα λέιζερ πέφτει σε ένα δείγμα, τα μόρια αντιδρούν με τρόπο που παράγει ένα φασματικό αποτύπωμα. Κάθε χημικός δεσμός έχει χαρακτηριστικές δονήσεις. Αυτές οι δονήσεις μπορούν να λειτουργήσουν σαν μοριακή υπογραφή.
Στη νέα εργασία, οι ερευνητές εστίασαν σε μια συγκεκριμένη φασματική ένδειξη: τη δόνηση «αναπνοής» του βενζολικού δακτυλίου της φαινυλαλανίνης. Η φαινυλαλανίνη είναι ένα αρωματικό αμινοξύ που εμφανίζεται σε πρωτεΐνες και μπορεί να συμμετέχει σε π-π αλληλεπιδράσεις. Όταν οι αρωματικοί δακτύλιοι μετακινούνται πιο κοντά ή αλλάζουν τρόπο στοίβαξης, η δόνηση αυτή μετατοπίζεται.
Η ερευνητική ομάδα έδειξε ότι αυτές οι μικρές μεταβολές μπορούν να λειτουργήσουν ως άμεσος δείκτης της ισχύος του pi-pi stacking. Με άλλα λόγια, η TRIP μετατρέπει μια πολύ λεπτή αλλαγή στις μοριακές δονήσεις σε σήμα που μπορεί να μετρηθεί, να συγκριθεί και να συσχετιστεί με τη βιολογική δράση ενός φαρμάκου.
Η εικόνα που χρησιμοποιεί η επικεφαλής ερευνήτρια Narangerel Altangerel είναι χαρακτηριστική: σαν να ακούει κανείς τη μουσική ενός μορίου και να αντιλαμβάνεται πώς αλλάζουν οι εσωτερικές του δυνάμεις σε πραγματικό χρόνο. Η μεταφορά δεν είναι υπερβολική. Οι δονήσεις είναι πράγματι συχνότητες. Και η αλλαγή τους μπορεί να αποκαλύψει τι συμβαίνει σε επίπεδο που δεν φαίνεται με γυμνό μάτι, ούτε αποτυπώνεται πάντα καθαρά σε στατική δομική εικόνα.
Γιατί επέλεξαν την κύρια πρωτεάση του SARS-CoV-2
Για να δοκιμάσουν την τεχνική, οι ερευνητές επέλεξαν έναν πολύ γνωστό και κλινικά σημαντικό στόχο: την κύρια πρωτεάση Mpro του SARS-CoV-2, του ιού που προκάλεσε την πανδημία COVID-19. Η Mpro είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό του ιού, καθώς συμμετέχει στην επεξεργασία των ιικών πολυπρωτεϊνών. Γι’ αυτό έχει βρεθεί στο επίκεντρο της ανάπτυξης αντιιικών φαρμάκων.
Η Mpro είναι επίσης κατάλληλο μοντέλο για τη μελέτη π-π αλληλεπιδράσεων, επειδή λειτουργεί ως διμερές. Αυτό σημαίνει ότι δύο αντίγραφα της πρωτεΐνης πρέπει να ενωθούν για να αποκτήσει καταλυτική δραστηριότητα. Η ένωση αυτή σταθεροποιείται από αρωματικές αλληλεπιδράσεις σε κρίσιμες περιοχές της πρωτεΐνης.
Σύμφωνα με τη δημοσίευση, η πρωτεΐνη σχηματίζει ενεργό διμερές που σταθεροποιείται από μια συντηρημένη αρωματική τριάδα, στην οποία συμμετέχουν η φαινυλαλανίνη-140, η ιστιδίνη-163 και η ιστιδίνη-172. Αυτό έδωσε στους επιστήμονες ένα ιδανικό σύστημα για να ελέγξουν αν η TRIP μπορεί να καταγράψει τις αλλαγές που συμβαίνουν όταν η πρωτεΐνη ενεργοποιείται, σταθεροποιείται ή αλληλεπιδρά με αναστολείς.
Το αποτέλεσμα ήταν ενθαρρυντικό. Καθώς η Mpro μετακινούνταν ανάμεσα σε ενεργές και ανενεργές καταστάσεις, η TRIP κατέγραψε αντίστοιχες μεταβολές στο φασματικό της αποτύπωμα. Οι αλλαγές δεν φάνηκαν τυχαίες. Ακολούθησαν συστηματικό μοτίβο, γεγονός που ενίσχυσε την εκτίμηση ότι η τεχνική δεν μετρά απλώς θόρυβο, αλλά πραγματικές αλλαγές στις μοριακές αλληλεπιδράσεις.
Από το φάσμα στη φαρμακευτική δράση
Το πιο ενδιαφέρον μέρος της μελέτης δεν ήταν μόνο η ανίχνευση των π-π αλληλεπιδράσεων. Ήταν η σύνδεσή τους με την αποτελεσματικότητα φαρμακευτικών αναστολέων. Οι ερευνητές εξέθεσαν την Mpro σε διάφορες αντιιικές ουσίες και παρακολούθησαν με την TRIP πώς άλλαζε το φασματικό σήμα.
Το μοτίβο που προέκυψε είχε σαφή φαρμακολογική σημασία. Οι ισχυρότεροι αναστολείς, όπως το MPI8 και το nirmatrelvir, προκάλεσαν τις πιο έντονες μεταβολές στη φασματική υπογραφή της φαινυλαλανίνης. Αντίθετα, μόρια όπως το halicin και το VB-B-145 εμφάνισαν ασθενέστερη εμπλοκή. Οι αλλαγές στο φασματικό σήμα συσχετίστηκαν με την αποτελεσματικότητα διμερισμού, με δημοσιευμένες τιμές IC50 και με αντιιική δράση σε κύτταρα A549-ACE2.
Αυτό είναι το σημείο που καθιστά την τεχνική ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα για τη φαρμακευτική βιομηχανία. Αν ένα φασματικό σήμα μπορεί να προβλέψει πόσο καλά ένας αναστολέας δεσμεύεται ή δρα, τότε η TRIP θα μπορούσε να λειτουργήσει ως εργαλείο πρώιμης επιλογής υποψηφίων φαρμάκων. Θα μπορούσε να βοηθήσει τους ερευνητές να ξεχωρίσουν γρηγορότερα ποια μόρια αξίζει να προχωρήσουν σε πιο σύνθετες δοκιμές.
Η δυνατότητα αυτή έχει ιδιαίτερη αξία επειδή η ανακάλυψη φαρμάκων είναι ακριβή, αργή και γεμάτη αποτυχίες. Πολλά μόρια φαίνονται καλά στα πρώτα στάδια, αλλά χάνουν την αξία τους όταν εξεταστούν σε πιο βιολογικά ρεαλιστικές συνθήκες. Μια μέθοδος που προσφέρει άμεση, μη επεμβατική, label-free μέτρηση σε πρωτεϊνικά περιβάλλοντα θα μπορούσε να μειώσει μέρος αυτής της αβεβαιότητας.
Η συμβολή των κβαντικών υπολογισμών
Η ομάδα δεν στηρίχθηκε μόνο στα πειραματικά δεδομένα. Χρησιμοποίησε και υπολογισμούς density functional theory, γνωστούς ως DFT. Πρόκειται για κβαντομηχανική μέθοδο που επιτρέπει τη μελέτη ηλεκτρονικής δομής και δονητικών μοτίβων σε μοριακά συστήματα.
Οι υπολογισμοί βοήθησαν τους ερευνητές να συνδέσουν τα φασματικά σήματα της TRIP με αναδιατάξεις ηλεκτρονικής πυκνότητας και με ειδικά μοτίβα δονητικής σύζευξης που εμφανίζονται όταν αρωματικά κατάλοιπα στοιβάζονται. Η σύμπτωση ανάμεσα στις μετρήσεις και στους υπολογισμούς ενίσχυσε την αξιοπιστία της τεχνικής.
Αυτός ο συνδυασμός πειράματος και υπολογισμού αποτελεί ένα από τα πιο ισχυρά στοιχεία της προσέγγισης. Η φασματοσκοπία δίνει το σήμα. Η κβαντική μοντελοποίηση εξηγεί γιατί προκύπτει αυτό το σήμα. Μαζί, μπορούν να μετατρέψουν μια παρατήρηση σε μηχανιστική κατανόηση.
Από την COVID-19 στον καρκίνο και το Αλτσχάιμερ
Η επιλογή του SARS-CoV-2 δεν σημαίνει ότι η TRIP περιορίζεται στις λοιμώξεις. Αντίθετα, οι ερευνητές την παρουσιάζουν ως γενικεύσιμο εργαλείο για τη μελέτη πρωτεϊνικών διεπαφών που βασίζονται σε αρωματικές αλληλεπιδράσεις. Αυτό ανοίγει θεωρητικά εφαρμογές σε πολλές θεραπευτικές περιοχές.
Στον καρκίνο, για παράδειγμα, πολλές παθολογικές διεργασίες εξαρτώνται από πρωτεϊνικά δίκτυα που επιτρέπουν στα κύτταρα να πολλαπλασιάζονται, να επιβιώνουν ή να μεταναστεύουν. Αν η TRIP μπορεί να δείξει πώς ένα φάρμακο διαταράσσει κρίσιμες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, θα μπορούσε να βοηθήσει στην αξιολόγηση νέων αντικαρκινικών μορίων.
Στη νόσο Αλτσχάιμερ και σε άλλες νευροεκφυλιστικές νόσους, η σταθερότητα και η λανθασμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών παίζουν καθοριστικό ρόλο. Μια τεχνική που ανιχνεύει πρώιμες αλλαγές στις δυνάμεις που κρατούν τις πρωτεΐνες σε συγκεκριμένη κατάσταση θα μπορούσε, μελλοντικά, να προσφέρει νέα εργαλεία κατανόησης ή προσυμπτωματικής αξιολόγησης υποψήφιων ενώσεων.
Στις λοιμώξεις, η λογική είναι πιο άμεση. Οι ιοί εξαρτώνται από πρωτεΐνες που επιτρέπουν την είσοδο, την αναπαραγωγή και τη συναρμολόγησή τους. Αν οι επιστήμονες μπορούν να παρακολουθούν πώς φάρμακα αποδυναμώνουν αυτές τις πρωτεΐνες, τότε μπορούν να επιλέγουν καλύτερα αντιιικά υποψήφια πριν από τα ακριβότερα στάδια ανάπτυξης.
Τι μπορεί να αλλάξει στο drug discovery
Η φαρμακευτική ανάπτυξη κινείται σήμερα ανάμεσα σε δύο μεγάλες πιέσεις: την ανάγκη για πιο γρήγορη ανακάλυψη και την ανάγκη για μεγαλύτερη ακρίβεια. Η τεχνητή νοημοσύνη, η υπολογιστική χημεία και οι πλατφόρμες υψηλής απόδοσης έχουν ήδη αλλάξει τον τρόπο με τον οποίο αναζητούνται υποψήφια μόρια. Όμως, όσο εξελιγμένα και αν είναι τα μοντέλα, χρειάζεται πάντα πειραματική επιβεβαίωση.
Η TRIP προσφέρει μια πιθανή γέφυρα ανάμεσα στον υπολογιστικό σχεδιασμό και στη βιολογική πραγματικότητα. Μπορεί να λειτουργήσει ως εργαλείο ελέγχου που δείχνει αν οι δυνάμεις που προβλέπει το μοντέλο εμφανίζονται πράγματι στο πρωτεϊνικό περιβάλλον. Μπορεί επίσης να βοηθήσει στην ιεράρχηση μορίων, πριν οι ερευνητές επενδύσουν χρόνο και πόρους σε κυτταρικές, προκλινικές ή κλινικές δοκιμές.
Το σημαντικότερο είναι ότι η μέθοδος δεν απαιτεί σήμανση του δείγματος. Η label-free φύση της μειώνει τον κίνδυνο να αλλοιωθεί το υπό μελέτη σύστημα από επιπλέον χημικές τροποποιήσεις. Αυτό έχει σημασία όταν η ερώτηση αφορά λεπτές μοριακές δυνάμεις που μπορεί να επηρεαστούν ακόμη και από μικρές παρεμβάσεις.
Γιατί χρειάζεται προσοχή
Παρά τον ενθουσιασμό, η τεχνική δεν πρέπει να παρουσιαστεί ως έτοιμη λύση για την άμεση παραγωγή νέων θεραπειών. Η μελέτη δείχνει ισχυρή απόδειξη αρχής και ενδιαφέρουσα εφαρμογή σε έναν σημαντικό πρωτεϊνικό στόχο. Δεν δείχνει ακόμη ότι η TRIP μπορεί να αντικαταστήσει τις καθιερωμένες μεθόδους αξιολόγησης φαρμάκων ή ότι μπορεί να προβλέψει με ακρίβεια την κλινική αποτελεσματικότητα σε ανθρώπους.
Η διαδρομή από μια φασματική μέτρηση έως ένα εγκεκριμένο φάρμακο παραμένει μεγάλη. Περιλαμβάνει χημική βελτιστοποίηση, τοξικολογία, φαρμακοκινητική, φαρμακοδυναμική, προκλινικά μοντέλα, κλινικές δοκιμές και αυστηρή ρυθμιστική αξιολόγηση. Η TRIP μπορεί να επιταχύνει ορισμένα στάδια. Δεν μπορεί να καταργήσει την ανάγκη για πλήρη ανάπτυξη και έλεγχο.
Χρειάζεται επίσης να φανεί πόσο γενικεύσιμη είναι η τεχνική σε διαφορετικές κατηγορίες πρωτεϊνών, σε πολύπλοκα βιολογικά δείγματα και σε φαρμακευτικά μόρια με διαφορετικές ιδιότητες. Το γεγονός ότι η ερευνητική ομάδα έχει καταθέσει αίτηση για αμερικανικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας δείχνει προοπτική τεχνολογικής αξιοποίησης, αλλά η μετάβαση από τεχνική σε ευρέως αποδεκτό πρωτόκολλο απαιτεί επαναλήψιμα αποτελέσματα από περισσότερα εργαστήρια.
Η μεγάλη εικόνα: φάρμακα σχεδιασμένα γύρω από τις δυνάμεις της νόσου
Η πιο ενδιαφέρουσα υπόσχεση της TRIP είναι ότι μεταφέρει τη φαρμακευτική έρευνα πιο κοντά στις ίδιες τις δυνάμεις που κινούν τη βιολογία. Δεν αρκεί να γνωρίζουμε ότι μια πρωτεΐνη έχει συγκεκριμένο σχήμα. Δεν αρκεί να γνωρίζουμε ότι ένα φάρμακο δεσμεύεται κάπου. Το κρίσιμο ερώτημα είναι ποιες δυνάμεις κρατούν αυτή τη δέσμευση, πώς αλλάζουν όταν το μόριο τροποποιείται και πώς αυτές οι αλλαγές μεταφράζονται σε βιολογική δράση.
Αν η TRIP επιβεβαιωθεί σε περισσότερα συστήματα, θα μπορούσε να ενισχύσει τη μετάβαση προς φάρμακα σχεδιασμένα με μεγαλύτερη μηχανιστική ακρίβεια. Αυτό δεν σημαίνει «κβαντική ιατρική» με ασαφή ή υπερβολικό τρόπο. Σημαίνει φαρμακευτικό σχεδιασμό που χρησιμοποιεί πραγματικές μετρήσεις κβαντικής φύσης αλληλεπιδράσεων, ώστε να κατανοεί καλύτερα γιατί ένα μόριο λειτουργεί.
Η ιατρική ακριβείας συνήθως συνδέεται με γενετικά προφίλ, βιοδείκτες και εξατομικευμένες θεραπείες. Η νέα εργασία προσθέτει μια διαφορετική διάσταση: ακρίβεια στο επίπεδο των δυνάμεων που οργανώνουν τις πρωτεΐνες. Αν αυτή η διάσταση συνδυαστεί με υπολογιστικό σχεδιασμό, τεχνητή νοημοσύνη και βιολογική επικύρωση, μπορεί να δώσει ισχυρότερα εργαλεία στην ανάπτυξη φαρμάκων.
Πηγη: https://healthpharma.gr